恐怖政治が行われているローマ。人々は権力を振りかざすスカルピアにおののいている。そんな中、脱獄に成功した政治犯アンジェロッティが教会の礼拝堂に逃げ込んでくる。そこでは同じく反体制派の画家カヴァラドッシが、祈りを捧げに来る貴婦人をモデルにマグダラのマリア像の壁画を描いていた。

彼は筆を休めて恋人トスカの肖像入りのメダルを取り出し、絵の中の婦人を見比べて恋人への高鳴る愛の気持ちを歌う…〈妙なる調和〉。
同志2人は再会を喜び合うが、トスカが来たのでアンジェロッティは身を隠す。彼女はカヴァラドッシへの愛を歌い上げながらもモデルの貴婦人に小さな嫉妬の炎を燃やす。それをなだめる彼…〈愛の二重唱〉。

3人が去った後にスカルピアが登場。戦勝を祝う聖歌隊の祈りをバックに、歌姫トスカへのよこしまな想いと邪悪な望みを独白する…〈テ・デウム（聖歌）〉。

ファルネーゼ宮にある警視総監の執務室。政治犯を匿った容疑でカヴァラドッシが尋問されているが何も答えない。トスカが到着しカヴァラドッシは別室に連行される。「さあ、二人だけで友人として話しましょう」と今度は彼女を問い詰めるスカルピア。だが口を割らないので部屋の戸を開けて、カヴァラドッシを拷問して苦痛に満ちた呻き声を聞かせる。とうとうトスカは耐えきれず、アンジェロッティの隠れ場所を洩らしてしまう。それを聞いて彼女をなじるカヴァラドッシだったが、その時ナポレオン侵攻の報が届き元気を取り戻す。

激怒したスカルピアは、カヴァラドッシを処刑するための牢獄に送り、トスカにカヴァラドッシの命と引き換えに貞操を求めて迫る。苦悩する彼女は神に訴えて「歌に恋に生き、信仰を捧げてきた自分に、なぜこのような試練をお与えになるのですか」と歌う…〈歌に生き、恋に生き〉（※ソプラノ屈指の名アリアとして有名）。
ついにトスカはうなだれてスカルピアに屈して、彼の要求をのむ代わりに見せかけの銃殺刑執行の約束をとりつけ、カヴァラドッシと一緒に国外に逃げるための通行許可証を発行してくれるように頼む。

だが彼がそれを書いている最中、トスカは発作的にテーブルからナイフをとり、スカルピアの胸に突き立ててしまう。そして死体になったスカルピアの手から通行証を奪いとり、恐怖と罪の意識に苛まれながら部屋を出るのだった。

夜明け前の聖アンジェロ城の屋上。処刑を待つカヴァラドッシがトスカとの愛の日々を追想しながら死への絶望を歌う…〈星は光りぬ〉（※イタリア・オペラを得意とするテノール歌手にとっての極めつけアリア）。
そこへトスカが現れ、処刑は空砲で行われる手はずになっていることを伝える。自由を手にする歓びと愛の勝利を高らかに歌い上げる二人。銃が火を噴き、カヴァラドッシが倒れ、トスカが駆け寄るが彼は本当に撃たれて死んでいた。

スカルピアは最初からトスカを騙すつもりだったのだ。追っ手が迫るなか、すべてを悟った彼女は「おおスカルピア、神の御前で！」と最後に絶叫して、城壁から身を投げる。オーケストラが〈星は光りぬ〉の旋律を劇的に奏でて全編の幕となる。